Influência das propriedades dos diferentes grafenos

Scientific Reports volume 12, Artigo número: 13408 (2022) Citar este artigo

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Compósitos de nanomateriais à base de polímero e grafeno (GBNs) combinam fácil processamento em geometrias de membrana 3D porosas devido ao polímero e aos estímulos de diferenciação celular devido aos enchimentos de GBNs. Com o objetivo de avançar na aplicação clínica de compósitos polímero/GBNs, este estudo realiza uma análise comparativa sistemática e detalhada da influência das propriedades de quatro diferentes GBNs: (i) óxido de grafeno obtido a partir de processos químicos de grafite (GO); (ii) óxido de grafeno reduzido (rGO); (iii) grafeno multicamadas produzido pelo método de esfoliação mecânica (Gmec); e (iv) grafeno pouco oxidado via esfoliação anódica (Ganodic); disperso em membranas porosas de policaprolactona (PCL) para induzir diferenciação astrocítica. Membranas planas PCL/GBN foram fabricadas pela técnica de inversão de fase e amplamente caracterizadas em morfologia e topografia, estrutura química, hidrofilicidade, adsorção de proteínas e propriedades elétricas. Foram realizados ensaios celulares com células de glioma C6 de rato, como modelo para astrócitos específicos de células. Notavelmente, a baixa carga de GBN (0,67% em peso) causou uma diferença importante na resposta da diferenciação C6 entre as membranas PCL/GBN. As membranas PCL/rGO e PCL/GO apresentaram os maiores marcadores biomoleculares para diferenciação de astrócitos. Nossos resultados apontaram para os defeitos estruturais químicos nos nanomateriais rGO e GO e os mecanismos de adsorção de proteínas como a causa mais plausível que confere propriedades distintas às membranas PCL / GBN para a promoção da diferenciação astrocítica. No geral, nosso estudo comparativo sistemático fornece conclusões generalizáveis e novas evidências para discernir o papel dos recursos de GBNs para pesquisas futuras em membranas de fibra oca compostas de PCL / grafeno 3D para modelos neurais in vitro.

A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura dinâmica e complexa de capilares cerebrais que controla seletivamente a homeostase do sistema nervoso central (SNC) e o protege de toxinas ou patógenos1,2. Infelizmente, muitas estratégias terapêuticas promissoras não apresentaram os resultados esperados, uma vez que a BBB representa um obstáculo crítico para o tratamento de doenças do SNC. Assim, impede que a maioria dos medicamentos terapêuticos entrem no cérebro devido às suas propriedades físicas, bioquímicas e de barreira específicas3,4.

O desenvolvimento de modelos neurais in vitro constitui uma fonte de conhecimento potencialmente essencial para a compreensão de doenças neurodegenerativas e para o desenho de novas terapias neuroprotetoras. Podem constituir uma oportunidade para planear novas plataformas de rastreio de medicamentos, baseadas em culturas de células neurais, para ensaios celulares direcionados a doenças neurológicas. A realização de modelos BBB in vitro é de extrema importância, pois ajudam a rastrear de forma confiável a eficácia de novos medicamentos e terapêuticas para distúrbios cerebrais. O desenvolvimento de modelos dinâmicos de BBB (DIV-BBB), que utilizam fibras ocas de polímeros comerciais como plataformas para cultura de células endoteliais em sua superfície luminal e recriam o ambiente fisiológico em termos de dinâmica de fluidos, demonstrou reconstrução in vitro de BBB muito mais eficiente (medida indiretamente através da resistência elétrica transendotelial (TEER)) do que o método de referência Transwell1,5. No entanto, os modelos DIV-BBB ainda apresentam valores de TEER muito mais baixos que os tecidos nativos da BBB.

A cocultura de células endoteliais com astrócitos tem sido proposta como um procedimento eficiente para melhorar a reconstrução da BHE in vitro, pois foi observado o papel fundamental que os astrócitos desempenham no desenvolvimento e função do cérebro, e na regulação do fenótipo do endotélio. células em modelos BBB através da regulação da comunicação célula-célula através de fatores solúveis e interações diretas entre células endoteliais-astrócitos6. Trabalhos em modelos DIV-BBB geralmente empregam coculturas de células endoteliais e de glioma de rato C6 induzidas a astrócitos7,8,9. Os protocolos bioquímicos para diferenciação de C6 são de alguma forma bem padronizados e, portanto, estes trabalhos assumem diferenciação astrocítica satisfatória. Porém, as fibras ocas poliméricas comerciais utilizadas para esta aplicação (principalmente polipropileno e difluoreto de polivinilideno) apresentam baixa adesão celular e são bioinertes. Além disso, em nosso trabalho anterior, observamos que, apesar de usar protocolos padrão para induzir a diferenciação de astrócitos de células C6 sobre a superfície de fibras ocas de polímero de policaprolactona (PCL), a taxa e a qualidade da diferenciação foram limitadas em contraste com o controle positivo de lamelas de vidro.

rGO (10.8%) > Gmec (3.6%) > Ganodic (3.0%). We note that, although in principle, the oxygen content could be also evaluated from the data gathered in Table 1 by making some assumptions on the bond type (e. g., epoxy or hydroxyl), the intrinsic asymmetry of the graphitic carbon band would usually lead to an overestimation of the oxygen atomic percent. Indeed, even when the graphitic bands are fitted with an asymmetric function, as in the present work (see “Graphene-based nanomaterials synthesis and characterization” for details), part of the intensity actually coming from the tail of the graphitic signal is wrongly assigned to oxygen-containing groups. However, although the oxygen content is more accurately determined from the survey spectra (Table S1), the deconvolution data are still useful for a semi-quantitative comparison between the different materials (Table 1)./p> PCL/Ganodic > PCL/rGO > PCL/Gmec. Particularly, on PCL/Gmec membranes (Fig. 3A) there were areas where Gmec was not detected. In contrast, the rest of PCL/GBN membranes presented GBNs concentration at any point measured on the surface. It is also remarkable the low absolute intensity of the Raman spectrum of PCL/Ganodic membranes (Fig. 3B) and the presence of high intensity bands corresponding to GO throughout PCL/GO surface (Fig. 3D). Raman and FTIR spectroscopy in Fig. S2A,B, respectively, confirm the presence of characteristic bands of GBNs in the PCL membranes./p> PCL/rGO (22.3 ± 2.7%) > PCL/Ganodic (9.1 ± 0.7%) > PCL/Gmec (8.8 ± 2.7%) > PCL (4.7 ± 2.7%). Specifically, PCL, PCL/Gmec and PCL/Ganodic membranes yielded round-cell morphology (Fig. 5A–C) and 60–75% of the total cells displayed only one cellular projection (Fig. 5G). Remarkably, C6 cells cultured on PCL/Gmec (Fig. 5B) formed cell clusters that resembled multicellular spheroid-like structures as previously reported63. In contrast, PCL/rGO and PCL/GO membranes substantially stimulated the formation of two to five cell extensions, resembling the typical stellate morphology of astrocytes (Fig. 5D,E,G). Both PCL/rGO and PCL/GO membranes promoted a marked change in cell shape to an asymmetrical shape with elongated processes. Around 22% and 31% of C6 cells exhibited more than two projections on PCL/rGO and PCL/GO membranes, respectively, a proportion significantly higher than that estimated in C6 cells grown on glass coverslips (positive controls), where only 3% of cells had more than two cellular projections./p> PCL/GO (2.37 ± 0.15) > PCL/rGO (2.33 ± 0.16) > PCL/Gmec (1.34 ± 0.13). Interestingly, the expression levels in PCL/Ganodic, PCL/GO and PCL/rGO membranes were significantly higher in comparison with the level in PCL membranes normalized to 1 (Fig. 5H). Regarding Slc1a3 (Glast) expression, only C6 cells grown on PCL/rGO (1.66 ± 0.31) and PCL/GO (2.97 ± 0.06) membranes showed significantly increased levels when compared with C6 cells cultured on PCL membranes (Fig. 5H). Finally, Fig. 5I presents the Western blotting of cell lysates, revealing a relative 1.6-times increase in nestin protein expression in C6 cells cultured on PCL/rGO and PCL/GO membranes compared to PCL./p> 99.8%, Honeywell) solutions and UV light, and washed with sterile PBS to remove EtOH traces, all in a laminar flow cabinet./p>